|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
|
Multivalentní sacharidové ligandy galektinů
Hovorková, Michaela ; Křen, Vladimír (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektiny jsou proteiny patřící do skupiny lektinů, které jsou schopné vázat sacharidové jednotky a dokážou specificky rozeznat glykany vystavené na povrchu buněk. Galektiny se in vivo účastní např. kancerogeneze, angiogeneze či fibrózy. Jejich výskyt signifikantně stoupá v souvislosti s řadou patogenních procesů, a proto je lze využít jako markery u některých typů rakovin nebo kardiopatologií a též pro cílenou vazbu terapeutik a/ nebo zobrazovacích činidel v diagnostice a terapii. Galektin-3 má specifickou strukturu označovanou jako chimerická a je schopný tvořit multivalentní oligomery. Přirozenými ligandy galektinů jsou glykany obsahující terminální β-galaktosidy, zvláště N-acetyllaktosamin, avšak vazba monovalentních glykanů je velmi slabá. Glykokonjugáty s vysokou afinitou ke galektinovým receptorům jsou optimálně multivalentní, biokompatibilní a stabilní in vivo. Tato kritéria splňují sacharidové ligandy konjugované na rozpustné a strukturně flexibilní N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidové (HPMA) kopolymery. V rámci této práce byly pomocí enzymové syntézy připraveny dva druhy funkcionalizovaných disacharidů, založené na N-acetyllaktosaminu (Galβ4GlcNAc) a jeho strukturním analogu N,N'-diacetyllaktosaminu (GalNAcβ4GlcNAc). Pro syntézu byl použit komerční enzym β-galaktosidasa z Bacillus...
|
|
|
Enzymová fukosylace oligosacharidů
Horáčková, Karolína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Fukosylované oligosacharidy se přirozeně vyskytují v těle savců, tvoří například antigeny krevních skupin nebo oligosacharidy mateřského mléka. Oligosacharidy mateřského mléka působí jako inhibitory epiteliální buňky trávicího traktu kojenců, čímž zabraňují vzniku průjmových onemocnění Mezi nejhojněji zastoupené oligosacharidy mateřského mléka patří 2' Syntéza fukosylovaných oligosacharidů je výhodná z hlediska suplementace do umělé kojenecké výživy, čímž lze riziko průjmových onemocnění snížit. Syntéza oligosacharidů mateřského mléka přirozeně probíhá v Golgiho aparátu pomocí fukosyltransferas, avšak glykosyltransferasy jsou obecně velmi stereo selektivní a jako donory používají cukerné nukleotidy, které jsou nestabilní a finančně nákladné. V rámci této práce je demonstrována příprava fukosylgalaktosy a 2' fukosyllaktosy pomocí mutantní α patřící do glykosidhydrolas (rodina GH 29), která díky mutacím vykazuje vyšší transglykosylační aktivitu. Rekombinantní enzym byl exprimován v a byla charakterizována jeho enzymová aktivita, pH a teplotní optimum. Jako donor pro enzymovou syntézu byl využit α Preparativně byla provedena pouze příprava 2 ktosy, přítomnost 2' reakční směsi byla potvrzena měřením hmotnostních spekter. Klíčová slova enzymová syntéza; fukosidasa; fukosylace; mateřské mléko; sacharid
|
|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
|
Multivalentní sacharidové ligandy galektinů
Hovorková, Michaela ; Křen, Vladimír (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektiny jsou proteiny patřící do skupiny lektinů, které jsou schopné vázat sacharidové jednotky a dokážou specificky rozeznat glykany vystavené na povrchu buněk. Galektiny se in vivo účastní např. kancerogeneze, angiogeneze či fibrózy. Jejich výskyt signifikantně stoupá v souvislosti s řadou patogenních procesů, a proto je lze využít jako markery u některých typů rakovin nebo kardiopatologií a též pro cílenou vazbu terapeutik a/ nebo zobrazovacích činidel v diagnostice a terapii. Galektin-3 má specifickou strukturu označovanou jako chimerická a je schopný tvořit multivalentní oligomery. Přirozenými ligandy galektinů jsou glykany obsahující terminální β-galaktosidy, zvláště N-acetyllaktosamin, avšak vazba monovalentních glykanů je velmi slabá. Glykokonjugáty s vysokou afinitou ke galektinovým receptorům jsou optimálně multivalentní, biokompatibilní a stabilní in vivo. Tato kritéria splňují sacharidové ligandy konjugované na rozpustné a strukturně flexibilní N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidové (HPMA) kopolymery. V rámci této práce byly pomocí enzymové syntézy připraveny dva druhy funkcionalizovaných disacharidů, založené na N-acetyllaktosaminu (Galβ4GlcNAc) a jeho strukturním analogu N,N'-diacetyllaktosaminu (GalNAcβ4GlcNAc). Pro syntézu byl použit komerční enzym β-galaktosidasa z Bacillus...
|
host ::
RSS.